Proteínas de Ferro-enxofre

Postagem para reunir artigos e referências sobre proteínas de ferro-enxofre, além dos casos especiais da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial, fotossíntese, etc.

  • Para quem ficou impressionado (eu fiquei!) com o “cabo” de 7 a 9 clusters de [FeS] presente no Complexo I, vejam esta enzima com 46 clusters [FeS]! A estrutura contém outras curiosidades como metais de tungstênio, canais para transporte de gases e hidratados, e grupos prostéticos incomuns! Alguém maluco o suficiente para modelar esta belezinha???
  • Estruturas cristalográficas de resolução ultra-aumentada permitem a “observação” de átomos de hidrogênio, pares eletrônicos e até, pasmen, densidade de carga de orbitais de fronteira. Vejam este artigo descrevendo uma proteína de [4Fe-4S] com resolução de 0.48 angstroms! Alguém interessado em construir um modelo híbrido QC/MM para esta proteína e verificar a precisão dos cálculos na reprodução da densidade de carga?

Aquaporina

Introdução

Aquaporina é uma proteína transmembrânica, presente e conservada em todos os Domínios da vida. É responsável pelo transporte rápido, seletivo e organizado da água, permitindo a hidratação, secreção, isto é, a manutenção da homeostase.

Para um transporte rápido, não seletivo e desorganizado, um simples buraco bastaria. Entretanto, essa proteína realiza um transporte extremamente específico sem perder a presteza. Sem domínios que conferem-lhe a seletividade, moléculas pequenas e carregadas poderiam também atravessá-las, tais como hidrônio (H3O+), amônia, peróxido (OH-), etc. E ainda, mesmo se o transporte fosse perfeitamente específica a água, prótons poderiam ser transportadas pelo Mecanismo de Grotthus. Apesar de todos os obstáculos, aquaporina tem todas essas características desejáveis. Certamente uma façanha biológica, que é estudada utilizando espectroscopia de raios-X em resolução sub-Angstrom, permitindo finalmente desvendar os mecanismos por trás dessa microscópica máquina.

Mecanismo de Grotthus

Mecanismo de Grotthus é um processo no qual prótons podem se difundir através da rede de ligações de hidrogênio entre as moléculas de água ou outros solventes com ligações de hidrogênio. Esse transporte ocorre através do salto de prótons entre íons de hidrônio e água, trocando a posição do próton no solvente, constituindo uma possível forma de transporte de íons mesmo quando há somente uma fila de moléculas de água no poro. Desta maneira, a aquaporina poderia ser permeável a H+, entretanto, isso não acontece devido ao domínio SF.

Ilustração do Mecanismo de Grotthus

Animação ilustrativa do Mecanismo de Grotthus

 

Características

O canal em si contém seis α-hélices, e uma sétima hélice pseudo-transmembrana. Aquaporina tem dois domínios conservados: NPA (dual asparargine-proline-alanine) e SF (arginine selectivity filter).  NPA é o domínio típico da aquaporina que se localiza perto do centro do poro; enquanto que o SF fica perto  da entrada extracelular do poro, atribuindo a proteína sua seletividade epônima.

Considerando que a proteína é transmembrânica, é somente natural que seja formada de unidades α-hélice, que é uma estrutura secundária principalmente hidrofóbica, associando bem à parte interna da bicamada lipídica. Entretanto, se a parte interna do poro fosse hidrofóbica também as moléculas de água seriam incapazes de atravessar. Por isso, os aminoácidos que se associam com as moléculas de água no interior do poro devem ser carregadas, como podemos conferir no resultado da espectroscopia de raios-X, ilustrados pelas figuras a seguir:

Visão tridimensional em cartoon da Aquaporina

Visão tridimensional em cartoon da Aquaporina gerado através do Pymol (PBD 5BN2)

 

Visão tridimensional em mesh da Aquaporina

Visão tridimensional em mesh da Aquaporina. Regiões apolares em vermelho e regiões carregadas/polares em verde.

Podemos reparar na representação em mesh acima que a maioria da lateral que interage com a parte apolar da bicamada lipídica é vermelha, isto é, os aminoácidos que são expostos na lateral são em sua maioria apolares, tornando seu posicionamento na membrana termodinamicamente favorável.

Imagem da estrutura tridimensional da Aquaporina

Imagem da estrutura tridimensional da Aquaporina com os domínios SF e NPA destacados. Em A, seis alfa-hélices transmembrânicos e uma hélice pseudo-transmembrânica colorida em verde e amarelo. Em B, posição destacada em vermelho das moléculas de água.

Como discutido no artigo, vários artigos apontavam o domínio NPA como o responsável pelo impedimento do Mecanismo de Grotthus, destacando razões como repulsão eletrostática, barreiras de configuração e penalidades de dessolvatação, consistentemente indicando o ponto no meio da hélice pseudo-transmembrânica, que forma um potencial positivo. Entretanto, essas explicações não são compatíveis com dados experimentais, que comprovaram que mutações no domínio NPA não aumentam a permeabilidade do poro por prótons, mas no SF sim. Os resultados da cristalografia de raios-X e simulações de dinâmica molecular discutidos no paper têm como objetivo explicar de maneira concisa a essa evidência experimental.

Snapshots de interação entre água e aquaporina dentro do poro

 

 

Interações Proteína-Água

Os autores com simulações de dinâmica molecular revelaram que as moléculas de água tem suas orientações restringidas, de maneira que as moléculas de água presentes no canal são orientadas de tal forma que o grupo doador de prótons aponta para o lado oposto do domínio NPA, e suas ligações de hidrogênio são perturbadas. Dessa forma, é quebrada uma condição importante para o mecanismo de Grotthus, as ligações de hidrogênio entre as águas, impedindo assim esse tipo de difusão de íons H+. Outros fatores apontados através de cálculos de densidade eletrônica foram que Arg227 do SF recebe uma grande concentração de carga positiva, que por sua vez repele íons hidrônio, novamente desfavorecendo o transporte de íons de H+.

As simulações ainda ilustraram um movimento em par das moléculas de água no domínio SF. Isto é, as posições 1,3 e 2,4 são ocupadas simultaneamente, e enquanto a molécula em 1 move-se para 2, em 3 a outra molécula move-se para 4. Esse funcionamento é completamente análogo ao do canal de transporte de potássio.

Ilustração do movimento em pares de moléculas de água na aquaporina

 

Por fim, temos a razão de porque o domínio SF tem tal seletividade com água: snapshots da simulação revelam que enquanto a água está dentro do SF, existem quatro ligações de hidrogênio entre água e os aminoácidos, o que não acontece com outras moléculas carregadas. Desta maneira, moléculas como íon hidróxido são discriminadas geometricamente pela proteína. Entretanto, essas quatro ligações poderiam constituir um problema. Com tantas interações, se a afinidade da água pela aquaporina fosse muito alta, a velocidade de transporte seria muito menor. Por isso, as quatro ligações são ligeiramente distorcidas, diminuíndo essa afinidade o suficiente para termos uma alta velocidade de transporte sem perda de seletividade.

Ilustração da interação entre uma molécula de água e o domínio SF

 

Conclusão

Essas relações da água com o domínio SF parecem ser ditadas por interações de ligação de hidrogênio proteína-água, e uma pertubação nessa estrutura de interações pode explicar porque o mecanismo de exclusão de prótons é tão afetado por mutações nos resíduos conservados de histidina e arginina no SF. Isso ilustra o quão finamente ajustado a geometria do canal de água é para suprimir a difusão de prótons sem afetar o transporte de água.

GPCR

G Protein-Coupled Receptors

Precision vs Flexibility in GPCR signaling

Nelson Orsalino Neto Schuback, 9010821, CCM-T25

This post consists in a review of  “Precision vs Flexibility in GPCR signaling, Matthias Elgeti et al.”.It is suitable to highlight that this review is focussed on expose the methodology, the results of the paper and develop further discussions to other students.


Introduction

Communication between different cells of an organism is essential to it’s own existence and operation. Cells must operate differently according to the organism’s condition, the only way it is possible is with cellular signaling. The mecanism behind cellular signaling is the secretion and acceptance of substances from cell to cell, this substances may be classified between three important classes: Hormones, Neurotransmitters and Citokynes. The signal is recognized by receptor proteins (intracellular or membrane proteins), generally this receptors are membrane bounded or integrated, so they can transduce signals from substances that do not cross the cellular membrane. One of the most important classes of membrane protein receptors is the G Protein-Coupled Receptors, GPCRs for the intimate. The vision is due to this receptors, specifically Rhodopsin, a GPCR that can detect signals indicating the presence of photons. As well, they are involved in many diseases, and are also the target of approximately 40% of all modern medicinal drugs, therefore consisting a great pillar of pharmaceutical industry.

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Structure and Mechanism

GPCRs constitute a large family of membrane protein receptors. Coupling with G Proteins, they are called seven-transmembrane receptors because they pass through the cell membrane seven times. The G protein–coupled receptor is activated by an external signal in the form of a ligand or other signal mediator. This creates a conformational change in the receptor, causing activation of a G protein. Further effect depends on the type of G protein. G proteins are subsequently inactivated by GTPase activating proteins, known as RGS proteins. There are two principal signal transduction pathways involving the G protein–coupled receptors: the cAMP signal pathway and the phosphatidylinositol signal pathway.

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Rhodopsin is light sensitive GPCR  involved in visual phototransduction. The cofactor Retinol is produced in the retina from Vitamin A, from dietary beta-carotene. Isomerization of 11-cis-retinal into all-trans-retinal by light induces a conformational change (bleaching) in opsin, continuing with metarhodopsin II, which activates the associated G protein transducin and triggers a Cyclic Guanosine Monophosphate, second messenger, cascade. Metarhodopsin II activates the G protein transducin (Gt) to activate the visual phototransduction pathway. When transducin’s α subunit is bound to GTP, it activates cGMP phosphodiesterase. cGMP phosphodiesterase hydrolyzes cGMP (breaks it down). cGMP can no longer activate cation channels. This leads to the hyperpolarization of photoreceptor cells and a change in the rate of transmitter release by these photoreceptor cells.


Experimental Techniques

Techniques involved in the experiment aim to study the conformational diversity of rhodopsin in membrane environment and extend the static picture provided by the available crystal structures.

- FTIR spectroscopy:

Infrared spectroscopy is a technique in which infrared electromagnetic waves are measured in order to identify compounds, generally organic. Infrared spectroscopy exploits the fact that molecules absorb specific frequencies that are characteristic of theirstructure, these absorptions are resonant frequencies. Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy is a measurement technique that guides the radiation throught an interferometer and applies Fourier transformation to obtain the spectrum.

- Molecular Dynamics (MD):

Molecular dynamics (MD) is a computer simulation method for studying the physical movements of atoms andmolecules, and is thus a type of N-body simulation.  The atoms and molecules are allowed to interact for a fixed period of time, giving a view of the dynamical evolution of the system. Because molecular systems typically consist of a vast number of particles, it is impossible to determine the properties of such complex systems analytically; MD simulation circumvents this problem by using numerical methods.

In the article, FTIR spectroscopy of the rhodopsin in the absence or presence of GαCT and GγCT, this experiment aimed to identify the binding modes of rhodopsin and these peptides. Furthermore, MD simulations were performed using rhodopsin crystal structures in order to study the flexibility of CL3, specially when GαCT and GγCT are interacting with the opsin.


Experimental Results

The experiment section was divided into two parts, first experiments involving FTIR spectroscopy and then experiments involving MD simulations. Each experiment takes a step forward to understand more the structure and the mechanism of Rhodopsin.

- (FTIR spectroscopy) Analysis of metarhodopsin states in equilibrium in a pH range: 

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The first experiment aimed to analyse the equilibrium between metastates of rhodopsin (MI, MIIa, MIIb, IIbH+) (Scheme 1) in a variance of pH. The technical data are listed above in the image caption, after choosing the wavelength to analyse the fraction of metastates  against pH variance. The result was plotted with Henderson-Hasselbalch equation plot for comparison proposes.

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(FTIR spectroscopy) Analysis of G Protein C-terminal interaction with metarhodopsin in a pH range: 

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This second experiment aimed to analyse the equilibrium between metastates of rhodopsin (MI, MIIa, MIIb, IIbH+), as before, but now interacting the rhodopsin with GαCT and GγCT. This experiment shows how G protein binding can stabilize rhodopsin’s structure in several pH. As Figure 2 shows, GαCT stabilizes MIIbH+ at higher pH (~pH9) and GγCT stabilizes MIIb and MIIbH+, but is less effective in the protonated form than GαCT.

(FTIR spectroscopy) Analysis of G Protein C-terminal binding influence in rhodopsin receptor structure: 

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This part of the experiment shows in Figure 3 how GαCT and GγCT binding change receptor structure. In Figure 3A the Protein Binding Spectra (PBS) of GαCT, with it’s high PBS values, is showed to has a high influence on receptor structure. In Figure 3B, PBS of GγCT tells that it has influence, but it is not so strong as GαCT interaction. Finally in Figure 3C, the mutant K231A interaction with GαCT is compared with the normal rhodopsin, the result shows it is not so different. It is important to highlight the shift in molecular vibrations after protonation, that is why the analysis takes data on spectra obtained after H2O/2H2O exchange.

(MD simulations) Analysis of GαCT-CL3 interaction:

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The 200-400 ns simulation of Cl3-GαCT interaction shows in three different situations (A- inactive, B- active, C- active binded to GαCT) how CL3 is flexible. The results A and B shows the high freedom degree of movement of CL3. In the result C, the CL3 is still the most flexible, althought it is much more stable than in the other analysed situations.

PS: It is important to highlight that the experiment arrangement data is all described in the figure captions.

- Discussion in the Free Energy Diagram of MI, MIIa, MIIb and MIIbH+:

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 The schematic free energy landscape illustrating the change of receptor conformations along the thermal activation path under physiological conditions showed that the energy of each metastate of rhodopsin and how binding GγCT and GαCT lowers it’s energy. In Figure 5A, GγCT binds almost equally to MIIb and MIIbH+, but the same does not occur with GαCT, which interaction lowers more the MIIbH+ energy.


Conclusion

The article shows that Rhodopsin’s perfect switching function depends on two factors: signal fidelity and speed. Fidelity relies in the first instance on the inactivating and activating retinal ligands which are covalently bound to the receptor and sufficiently potent to shift the equilibria of receptor conformations to the inactive or active side. Equally important, however, is an accurate and productive coupling mechanism of the activated receptor and G protein.

ATP Sintase

A ATP Sintase é uma proteina de membrana que utiliza um gradiente favorável de prótons a fim de produzir ATP a partir de ADP e fosfato orgânico. Essa produção de ATP ocorre acoplado ao movimento de giro que ela faz devido as mudanças conformacionais causadas pela passagem de prótons, sendo comparada como uma espécie de motor ou máquina,  no ser humano, ela pode ser encontrada na membrana interna da mitocondria neste caso, se utilizando do gradiente de protóns criado pela cadeia transportadora de eletrons para produzir o ATP (é responsavel pela maior parte da produção de ATP). Nesse trabalho também falaremos da Cardiolipina, um fosfolipideo cujo as funções prováveis são de “lubrificar” a ATP Sintase e servir como carregadora de prótons, ajudando na função dessa.

 

ATP Sintase

A Estrutura da ATP Sintase esta mostrada acima, ela consiste em duas regiões. A Fo é o canal localizado na membrana interna da mitocondria por onde passa o fluxo de prótons. Com subunidades principais A,B e E, compostas principalmente por alfa hélices. A subunidade C também é conhecida como anel-C, pois forma uma espécie de anel de alfa-hélices, essa subunidade será bastante discutida no artigo, devido sua interação com a Cardiolipina.
A segunda região é conhecida como F1 localizada na matriz mitocondrial, nela que ocorre a formação de ATP e a saída do fluxo de prótons. Com subunidades principais que vão de alfa até épsilon, formadas por alfa hélices e folhas beta. As subunidades alfa e beta catalisam a produção de ATP devido a mudanças conformacionais causadas pela rotação da subunidade gama.

A estrutura da cardiolipina consiste de dois grupos 3-fosfatidil interligados por uma ponte de glicerol. Ela é frequentemente encontrada em mitocôndrias, na membrana interna. Sugere-se que em condições fisiológicas o hidroxil central e os dois fosfatos formam uma estrutura de ressonância ao aprisionar um próton, gerando uma carga negativa total na cardiolipina. Mesmo assim, valores de pKa dos fosfatos indicam que a “cabeça” da cardiolipina mantém duas cargas negativas em condições fisiológicas.
Sugere-se que a cardiolipina age estabilizando e lubrificando o c-ring da ATP-sintase ou ajudando na transferência de prótons que garante a força motriz do rotor (sabe-se que ela e outros fosfolipídios são essenciais para a ativação da ATP-sintase).

Resultado de imagem para cardiolipin 3d structureResultado de imagem para cardiolipin 3d structure

 

Para o experimento usado no artigo foram feitas simulações de comprimento de 2×4 microsegundos, nessas simulações foram levadas em conta as principais interações entre os anéis-C das proteinas de membrana e os lipídeos que as circundavam além da movimentação desses. As coordenadas das proteinas foram obtidas do PDB (códigos 2XND, 2XOK e 2WGM) e foram simuladas levando em consideração protocolos citados no artigo. Uma das limitações das simulações foram os tamanhos delas, relativamente reduzidos em comparação ás outras simulações na área. E, apesar do tipo de simualção permitir a visualização das interações entre lipídeos e proteína em escala de tempo apropriada, as estruturas secundarias são fixas, não permitindo a visualização da interação proteína-proteína.

Falaremos agora sobre os resultados e conclusões das simulações presentes no artigo, dando enfoque a interação da ATP-Sintase com a Cardiolipina.

ATP Sintase
No artigo em questão foram feitas simulações com 4 ATP-Sintases diferentes, a diferença analisada está presente no anel anel-C variando tamanho desses, assim esses 4 anéis-C diferentes foram C8, C8 desmetilado, C10 e C11. As estruturas dos anéis se mostrou essencialmente a mesma no decorrer das simulações, como podemos ver na figura acima (S1 do artigo).
Neste caso anéis maiores se mostraram mais estavéis devido a interação entre residuos de subunidades diferentes, estabilizando a estrutura. Vale ressaltar que os lipídeos foram dispostos de forma concêntrica, seguindo a simetria do anel e facilitando a simulação.

Agora vamos apresentar os resultados de cada simulação, para isso vamos primeiro introduzir principais residuos chaves para interação em cada um dos anéis apresentados e como eles influenciam as densidades de lipídeos em volta do anel.
C8: O anel C8 apresentou uma maior densidade de cardiolipina (e de outros fosfolipídeos) principalmente ao redor dos residuos Lys-43 e Lys-7 mas tambem nos residuos Gln-44, Gln-45 e Ser-48, como podemos ver na figura abaixo (1 do artigo). Os gráficos de cima são as interações com a Cardiolipina e os de baixo com outros fosfolipídeos.
ATP Sintase

C8 Desmetilado: A desmetilação in silica do residuo Lys-43 aumentou a interação com do resíduo com a Cardiolipina, sem alterar o tempo de residência. Os outros resíduos, que já realizavam ligações com cardiolipina, mantiveram a mesma interação. Isso só ocorreu pela fraca interação vista no potencial de Lennard-Jones, como na figura abaixo(S4 do artigo):

ATP Sintase

C10: a cardiolipina se liga principalmente nos resíduos Lys-44 e Lys-8 (equivalente ao Lys-7 dos anéis anteriores). Em termos relativos, como observado na figura abaixo (S6 do artigo), a ligação é mais fraca, se comparada com o C8 desmetilado e mais forte, se comparada com o C8 metilado. O tempo de residência observado foi ligeiramente maior.

ATP Sintase

C11: os fosfatos de cardiolipina se ligaram ao redor do resíduo Lys-50 (que é parecido com o Lys-47 bovino) por longos períodos. O tempo de residência das cardiolipinas nas partições interiores e exteriores da membrana foram os maiores  observados nas simulações (600 e 300ns, respectivamente).

ATP Sintase

Um ponto estrutural importante dos anéis-c da ATP-sintase é a simetria radial de sua disposição espacial. Nas simulações os lipídios foram dispostos radialmente, facilitando a medição da densidade normalizada nas simulações, como ilustrado na Figura 2 do artigo:

ATP Sintase

As simulações mostram como certas regiões dos anéis evoluíram para atrair preferencialmente as moléculas de cardiolipina aos outros fosfolipídeos, e que certas modificações do anel influenciam a densidade e tempo de permanência dessa cardiolipina, mostram também como as cardiolipinas ficam ligadas a essas unidades. O vídeo abaixo mostra que o anel atrai preferencialmente a cardiolipina:

Ainda com as simulações e resultados obtidos pôde-se inferir algumas funções para a cardiolipina em relação a ATP-Sintase, como a de lubrificante enquanto essa ’gira’ pela bicamada. Com cálculos detalhados no artigo, sempre haverá de 3 a 4 cardiolipinas ligadas ao anel C da ATP- sintase. Esse efeito permite que ela gire com maior facilidade na bicamada fosfolipídica, além de estabilizar o anel.

Outra provável função vem do fato da cardiolipina poder ser uma carregadora de prótons pela membrana, assim, ela pode auxiliar tanto no bombeamento de prótons quanto para evitar o acúmulo de prótons na saida da ATP-Sintase.

 

 

 

Complexo IV (Citocromo c Oxidase)

Introdução

A Citocromo c Oxidase (CcO) é uma enzima de grande relevância metabólica. Sua importância reside na catálise do último passo na cadeia de transferência de elétrons, sendo protagonista enquanto sítio regulatório para a oxidação fosforilativa. No processo de redução de oxigênio para água, sua participação é essencial na medida que permite a manutenção do gradiente de prótons necessário à síntese de ATP.

Sua estrutura pode ser entendida, basicamente, como dois grupos heme envoltos pelo lipídeo diestearoil-3-sn-fosfatidiletanolamina, uma proteína repleta de alfa-hélices e íons de cobre II, cálcio e magnésio, com o cobre especialmente importante na entrada do oxigênio na molécula. Em particular, a estrutura lipídica apresenta importante papel na preservação da integridade estrutural da proteína (9). Para a simulação descrita no artigo, a estrutura da enzima foi a descrita no PDB 1M56, da bactéria Rhodobactor sphaeroides.

Essa enzima pode conter subunidades que variam em número dependendo do organismo, com a CcO humana apresentando 13 subunidades. A subunidade I é a mais conservada, além de ser onde se encontram os grupos heme e um átomo de cobre que integra um sítio catalítico. A CcO é uma proteína de membrana, com os átomos de oxigênio e nitrogênio carregados em seu exterior, o que aumenta sua reatividade.

Na análise em questão, realizou-se uma simulação coarse-grained model (CGM) para avaliar as diferenças de voltagem na membrana (fig2). Nessa aproximação, como os eletrólitos, eletrodos e a própria membrana foram descritos explicitamente, não se perde muito na questão dos erros. Para essa simulação, os autores fizeram aproximadamente dois milhões de passos em simulação de Monte Carlo para estudar os sistemas, que posteriormente foram submetidos à voltagens que possibilitaram a discussão do seguinte problema:

Uma comparação entre as diferenças de voltagem calculadas e observadas pode diferenciar entre caminhos de reação distintos?

O entendimento detalhado das questões energéticas que envolvem o bombeamento é um desafio da biofísica desde 2007 (4), pois apesar da existência de propostas mecanísticas, elas não apresentam consistência entre função e estrutura. Isso dificulta a análise na medida que não é possível obter “características detalhadas do bombeamento de prótons, e até agora as barreiras energéticas com base na estrutura ainda não foram determinadas com acurácia suficiente”.

Apesar dessa possível imprecisão, trabalhos anteriores de Kim e Warshel (especialmente a ref 8) permitem que essa simulação seja considerada válida para a análise do problema. Isso se deve à comprovação do modelo para CcO descrito na referência 8, cujo resultado impressiona em vista da possibilidade de maior confiança nos modelos computacionais do que em suposições eletrostáticas contínuas.

Como é possível observar na fig 1, existem diversos caminhos que permitem a translocação de cargas, já descritos desde (4), com importância fundamental dos íons de cobre e grupos heme.

Resultados e Discussão

A abordagem utilizada pelo artigo combina CGM e análise da energia livre total da membrana. Através desta análise determina-se o potencial externo de maior relevância como aquele que gera o estado de mínima energia livre na membrana. Essa abordagem já havia sido validada no estudo de Kim et al (2014) sobre o centro reativo de bactérias. Assim, foi possível aplicá-lo na CcO com o intuito de tentar discriminar caminhos reacionais distintos de eletrogenicidade através da diferença de voltagem aplicada.

Percebeu-se que a diferença de voltagem observada variava drasticamente de acordo com o tipo de membrana e entre mutantes distintos. Para as comparações serem válidas foi introduzida a grandeza fractional voltage, que é definida pela razão entre uma dada diferença de voltagem e a voltagem gerada pela transferência de uma carga completa através da membrana.

Na sequência, iniciou-se um processo de modelar os três caminho propostos pela fig 1 e tentar associar as diferenças de voltagem medidas com os dados experimentais. Estudos apontavam o resíduo D407 (fig 1) como o principal candidato a Proton Loading Site. A modelagem de caminhos reacionais diferentes permitiu uma descrição alinhada com os dados experimentais utilizando essa hipótese e serviu como suporte a ela.

Em suma, através de uma análise criteriosa de três caminhos reacionais possíveis, constatou-se que conquanto a geração de gradientes elétricos distintos, os valores obtidos após as normalizações e correções necessárias não permitem diferenciação inequívoca entre as vias de reação como era pensado anteriormente em trabalhos como Belevich et al (2007), Exploring the proton pump mechanism of cytochrome c oxidase in real time. Mostrou-se ainda que mesmo conclusões mais qualitativas, como as baseadas na distância da carga transferida ao longo da direção perpendicular à membrana, precisavam ser estudadas mais cautelosamente (Belevich I, et al. (2010) Initiation of the proton pump of cytochrome c oxidase).

Aponta-se para o fato de que usando uma melhor resolução temporal o resultado obtido pela simulação possa gerar uma análise menos ambígua. Ainda, como as medidas de voltagem refletem principalmente o movimento de cargas de maneira perpendicular à membrana, acredita-se que a análise de mecanismos com tempos de movimentação transmenbranar diferentes possa ser relevante.

Qual a importância?

Além da importância teórica de desenvolver uma ferramenta para cálculo de diferenças de voltagem em membranas, a análise simulação sobre a citocromo c oxidase permitiu insights maiores sobre reações de transferência de carga, estudadas desde 1956 por Rudolph A. Marcus, que em 1992 recebeu o Prêmio Nobel de Química “por suas contribuições para a teoria de reações de transferência de elétrons em sistemas químicos”. Soma-se a isso o esclarecimento mecanismos não detectáveis por espectroscopia – como a localização do PLS citada acima, e o questionamento do modelo que era aceito sobre a CcO devido ao questionamento da unicidade dos dados encontrados em diferentes vias de reação.

 

Bibliografia

  1. Kim I, Warshel A (2016) Analyzing the electrogenicity of cytochrome c oxidase. Proc Natl Acad Sci USA Proac Natl Acad Sci USA 12;113(28):7810-5. doi: 10.1073/pnas.1608118113. Epub 2016 Jun 28
  2. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1M56 (acessado em 24/09/2016)
  3. http://pdb101.rcsb.org/motm/5 (acessado em 24/09/2016)
  4. Olsson MHM, Siegbahn PE, Blomberg MR, Warshel A (2007) Exploring pathways and barriers for coupled ET/PT in cytochrome c oxidase: A general framework for examining energetics and mechanistic alternatives. Biochim Biophys Acta 1767(3):244–260.
  5. Olsson MHM, Warshel A (2006) Monte Carlo simulations of proton pumps: On the working principles of the biological valve that controls proton pumping in cytochrome c oxidase. Proc Natl Acad Sci USA 103(17):6500–6505.
  6. Chakrabarty S, Namslauer I, Brzezinski P, Warshel A (2011) Exploration of the cytochrome c oxidase pathway puzzle and examination of the origin of elusive mutational effects. Biochim Biophys Acta 1807(4):413–426.
  7. Kim I, Warshel A (2014) Coarse-grained simulations of the gating current in the voltage-activated Kv1.2 channel. Proc Natl Acad Sci USA 111(6):2128–2133.
  8. Kim I, Chakrabarty S, Brzezinski P, Warshel A (2014) Modeling gating charge and voltage changes in response to charge separation in membrane proteins. Proc Natl Acad Sci USA 111(31):11353–11358.
  9. Ferguson-Miller S, Hiser C, Liu J. Gating and Regulation of the Cytochrome c Oxidase Proton Pump. Biochimica et Biophysica Acta. 2012;1817(4):489-494. doi:10.1016/j.bbabio.2011.11.018.

 

Dinâmica e organização de receptores proteicos na membrana plasmática

INTRODUÇÃO

O estudo e entendimento da composição química e a própria dinâmica molecular das membranas plasmáticas é uma consquista relativamente recente na biologia, a qual não fora possível sem a grande contribuição da física, química, matemática e em especial contexto para a ciência da computação que permitiu a montagem e vizualização das estruturas protéicas e macromeleculares que juntas  formam os sistemas biológicos.

Representação simplificada e pictórica para a dinâmica molecular da membrana plasmática.

mosaico fluido

Modelo do mosáico-fluído proposto por SInger & Nicolson.

Com a teoria do mosaíco-fluído (Singer and Nicolson, 1972) foi possível se compreender melhor acerca dos aspectos gerais e particulares de algumas estruturas de membranas já estudadas, assim como comprovar que a composição das membranas além ser realmente heterogênea em demasia, a função celular ou até mesmo da organela em questão eram a chave para a compreensão das escolhas e montagem da membrana. Sendo assim, o conceito de membrana assimétrica se torna de suma importância para o entendimento da participação interna e externa da membrana para os processos globais e os denominados domínios proteicos presentes em todas as membranas, os quais promovem a seletividade e semi-permeabilidade de cada local na bicamada.

lipidios membrana

Distribuição assimétrica de fosfolipídios entre as camadas internas e externas da membrana plasmática de um eritrócito.

composicao lipidica

Composição lipídica da membrana plasmática e organelas celulares de um hepatócito de rato.

METODOLOGIA

Para a construção dos modelos de PM, cada simulação utiliza uma estrutura diferente que mimetiza uma secção da membrana plasmática na forma retangular em solução aquosa como nos ilustra o recorte da figura 1 do trabalho.

Figura 1 – Modelo utilizado para mimetizar a membrana plasmática. As cores para cada sistema representa: PC – azul escuro, PE – roxo, Sph – cinza escuro, GM3 – azul claro, Chol – verde, PS – cinza claro, PIP2 – laranja. (a) Modelo PM sem proteína, com 54 000 lipídios (b) Modelo TMH contendo 576 hélices TM repetidas em vermelho e 63 342 lipídios , (c) Sistema GPCR, contendo 144 receptores S1P1 em rosa e 59 616 lipídios.

O sistema PM consiste em uma mistura lipídica de diferentes composições nas porções exteriores e interiores, consistindo em 54 000 lipídios sem nenhuma proteína, o qual foi padronizado pelo método aquoso de MARTINI. Já para os sistemas TMH e GPCR duas diferentes protéinas transmembranas foram ultizadas, sendo a gp130 ou IL6ST, pertencente aos receptores IL-6 de citocinas,para o modelo de TMH e um modelo 3V2W para o modelo de GPCR.

RESULTADOS

Os três sistema estudados para a dinâmica da PM foram simulados em um mesmo espectro temporal para análises comparativas de dinâmica molecular assim como entender as influências específicas na presença e ausência de proteínas transmembranas como no caso do TMH e GPCR. Como podemos observar na figura 2 é evidentente após determinado tempo de simulação que o sistema PM tem uma acentuada curvatura se comparado com os demais sistemas, enquanto que os sistemas de TMH e GPCR aprensentam um estabilidade global mais evidente, em especial relação com a inserção de GPCR na PM.

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Figura 2 – Evolução dinâmica dos modelos empregados.

A figura 3 corrobora o resultado observado na figura anterior, haja visto que pela densidade de distribuição dos lípidios para cada sistema de membrana, é possível se observar uma maior dispersão nos sistemas PM e TMH, enquanto que o sistema de GPCR conserva em uma região específica suas difusões lipídicas. Portanto, a curvatura observada no plano das bicamadas para o sistema de GPCR se mostra pouca inalterada o que se deve em grande parte à participação e interação da proteína transmembrana presente assim como a composição lipídica.

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Figura 3 -Distribuição de densidade lipídica para todos os lipídios em diversos intervalos exceto para o colesterol.

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Figura 4 – Curvatura da membrana e deformações para os três sistemas. As cores correspondem a posição no eixo z dos grupos lipídicos. Os zooms destacados na figura c se referem aos oligômeros de GPCR.

Em termos da difusão lipídica, técnica de grande recorrência nos estudos de dinâmica molecular para sistemas biológicos em especial refreência para o coeficiente de difusão, podemos avaliar o comportamento para cada sistema, mostrando que para o sistema PM houve uma pequena diminuição da difusão, assim como havia sido mostrado por outras pequenas simulações in silico já realizadas anteriormentea, além de ser obsrvada em sistemas in vivo devido a participação de glicoproteínas ancoradas à membrana. Para o sistema TMH a presença da gp130 não modificou significativamente o padrão geral da difusão lipídica em comparação com o sistema PM, apenas diminuindo a movimentação dos resíduos proteicos em relação aos lipídios presentes na membrana.

Tampouco, quando analisamos a inserção de GPCR no sistema há uma redução muito significativa do coeficinte de difusão lipídica assim como o comportamento do conjunto químico a qual o GPCR esta agrupado, sendo já mencionado nas análises anteriores acerca da curvatura e deformações de cada sistema de membrana, o que nos indica ser a resposta para as pequenas oscilações obtidas para o GPCR, uma vez que as difusões lipídicas estão mais esparsas com o tempo e com menor intensidade, o que promove uma maior rigidez e menor flutuação no sistema como um todo. Em suma,  partir do cálculo dos coeficientes de difusão para cada sistema fora possível se determinar a similaridade entre outras simulações realizadas com modelos semelhantes, além de permitir a observação de fenômenos encontrados nos sistemas biológicos como a interação específica de lípidios e proteínas como o colesterol e também fosfatidilinositol-4,5-bifosfato. Os resultados dessa análise podem ser obervados na figura 5.

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Figura 5 – Difusão lipídica.

Quando analisamos as interações entre proteína – lipídio para os sistemas de TMH e GPCR percebemos uma ligeira semelhança e homologia no comportamento nas interações entre suas estruturas intermembranares e com o colesterol, fosfatidilinositol-4,5-bifosfato e fosfatidilcolina. Em especial ênfase para a interação do colesterol com a o sistema de GPCR, motrando uma possível regulação do colesterol para o funcionamento do GPCR, assim como observou evidências de interação do colesterol com diferentes tipo de proteínas pertencentes ao sistema TMH. As figuras 6 e 7 ilustram os resultados supracitados em termos das interações entre os sistemas proteicos e os lipídios e o estudo mais aprofundado entre a função e interação entre colesterol e fosfatidilinositol-4,5-bifosfato para os sistemas de GPCR.

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Figura 6 – Avaliação da interação proteína – lipídio em uma simetria radial.

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Figura 7 – Estudo na interação proteína – lipídio no sistema GPCR.

Além da interação proteína – lipídio ser observada como alvo de regualção dos próprios sistemas TMH e GPCR, as interações proteína – proteína também foram avaliadas e estudadas para ambos os sistemas, mostrando a  significativa formação de conjuntos de proteínas em forma de oligômeros para o sistema TMH, enquanto que para o sistema de GPCR apenas fora observado a vizualização de dímeros no início da simulação, descrecendo ao longo do tempo, como pode ser analisado pela figura 8, assim como a importante influência de colesterol e fosfatidilinositol-4,5-bifosfato para o funcionamento e interação dos sistemas de TMH e GPCR com eles mesmos e a própria membrana.

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Figura 8 – Oligomerização do sistema de GPCR.

DISCUSSÕES

Apesar de muitos resultados obtidos nas simulações supracitadas serem corroborados por estudos realizados in vitro  a sua grande importância está contida no sucesso de uma simulação para o estudo dinâmico molecular da membrana conseguir responder de forma verossímil aos dados já obtidos e permitir o melhor entendimento das próprias interações entre proteínas e lipídios.

Muito embora o modelo usado tenha sido adaptado para as simulações em in silico e que deveriam ser introduzidas mais variáveis biológicas para que a similaridade entre o sistema in vivo fosse mais fidedigno, os resultados obtidos e as observações analisadas se mostraram uma excelente aproximação das membranas biológicas, assim como a confiabilidade estatística nos dados processados é intimamente relacionada ao número de simulações processadas para cada sistema mimetizado.

Sendo assim, é relevante notar que para cada sistema em especial referência para o sistema GPCR a importância da interação entre a bicamada e o colesterol com o seu fincionamento, além de se poder vizualizar a possibilidade de oligomerização entre os sistemas de GPCR e suas consequências para o funcionamento da transdução de sinal, principalmente em relação ao receptor S1P1 e sua interação com  fosfatidilinositol-4,5-bifosfato na porção interna da bicamada, assim como as interações específicas realizadas pelo colesterol e as hélices presentes nos diferentes domínios de GPCR tanto nas porções superiores como inferiores da bicamada, os quais pouco influenciaram na regulação do sistema TMH e PM.

Em suma, podemos avaliar o trabalho global como uma grande contribuição para os estudos na dinâmica molecular da membrana plasmática, embora haja limitações que precisam ser corrigidas e sanadas em termos de precisão e melhor aproximação com os sistemas biológicos, é indubitável que os resultados obtidos perante as simulações são muitos promissores e relevantes para o melhor entendimento nas relações de interação proteína – proteína e proteína – lipídio.

 

Complexo Mitocondrial I

O que é o complexo mitocondrial I e qual o seu papel biológico?
O complexo mitocondrial I nada mais é do que a maior enzima da cadeia de transferência de elétrons, também é conhecida como NADH-quinone oxidoreductase, nome bem escolhido pois ilustra seu mecanismo molecular de funcionamento. Este mecanismo se baseia na catálise de diversas reações de oxirredução, reações as quais tem como responsabilidade a realização da transferência de elétrons entre moléculas de NADH e a Quinona (Q). Seu papel biológico está intrinsecamente ligado ao processo de respiração celular pois a transferência de elétrons trata-se de uma etapa crucial para que a respiração celular ocorra. Portanto, o complexo I contribui neste processo com a geração de um gradiente eletroquímico na membrana através do bombeamento de prótons.

Imagem 1 - Complexo I

Imagem 1 – Complexo I

Mas, como é a estrutura do complexo 1?
O complexo 1 possui 3 tipos diferentes de ligantes, estes são: FMN (Flavin Mononucleotide), SF4 (Cluster de ferro/enxofre) e FeS (Fe2/S2 (inorgânico) cluster). Estes ligantes são de extrema importância na transferência de elétrons; por exemplo, a FMN é quem “recebe” os elétrons advindos da oxidação de NADH, sendo assim essenciais para o funcionamento da proteína. O caminho percorrido pelos elétrons por meio destas moléculas e de resíduos carregados é chamado de “E-channel”.

Imagem 2

Imagem 2 – FMN, SF4, FeS

Na imagem 3 podemos observar a estrutura tridimensional desta proteína com algumas de suas subunidades marcadas para fácil identificação. O complexo 1 possui 13 subunidades distintas e dentre todas elas vale ressaltar neste momento duas, as quais serão amplamente comentadas aqui. Estas são as subunidades Nqo4 e Nqo8. A Nqo4 é uma subunidade hidrofílica e forma o sítio onde Q passa por uma redução e protonação, já Nqo8 possui uma serie de resíduos carregados e se encontra dentro da membrana, compondo parte do “E-channel”.

Na introdução falamos em redução da Quinona e sobre bombeamento de prótons, mas qual a relação entre as duas coisas?
Acontece que o processo de transferência de elétrons é extremamente importante para que o bombeamento de prótons ocorra, muitos pesquisadores já se perguntaram se a transferência de elétrons é o processo responsável pelo acoplamento da reação que transloca prótons pela membrana, mas através de simulações moleculares a resposta foi negativa, uma vez que a transferência de elétrons e o bombeamento de prótons estão ambos separados por uma grande escala de tempo e de distância física. Contudo, sem a transferência de elétrons não há bombeamento, pois o acoplamento da translocação de prótons pela membrana se dá pela redução de Q. Para que Q seja reduzida, no entanto, é necessário que haja oxidação da molécula de NADH e que E-channel transfira os elétrons necessários para que Q se reduza. Portanto, apesar da transferência de elétrons não acoplar o bombeamento de elétrons, ela é indiretamente responsável pelo acoplamento. A imagem abaixo mostra o complexo I inserido na membrana, onde a seta vermelha está indicando a localização dos clusters Fe-S e das vias FMN, os quais fazem uma ponte entre a subunidade hidrofílica Nqo4 desenhada em rosa e a subunidade Nqo6 que está embebida na membrana. As flechas em azul claro indicam o bombeamento de prótons, mostrando a sua intimidade com a transferência de elétrons. Nota-se que as subunidades Nqo14, Nqo13 e Nqo7/10/11 se comportam como subunidades antiporters e que Q está em contato com os resíduos Asp-139, His-38 e Tyr-87 da subunidade Nqo4, em rosa.

Imagem 3 – Subunidades Nqo8 (Verde Claro), Nqo4 (Rosa), Nqo6 (Verde Escuro), Nqo14 (Amarelo), Nqo13 (Azul), Nqo12 (Vermelho), Nqo7/10/11 (Cinza). Em roxo temos Q onde ocorre a transferência de elétrons na via FMN e de clusters de Fe-S.

Verificando a atuação da redução de Q no bombeamento de prótons

No artigo Euro et al. é sugerido que as cargas negativas de Q⁻² e Q⁻¹ podem gerar um desbalanço de cargas na cavidade onde se encontra o sítio de ligação de Q, fazendo com que esse desbalanço de cargas gerem mudanças conformacionais a longa distância devido a propagação do desbalanço de cargas. Utilizando-se simulações QM/MM (quantum mechanics/molecular mechanics), Sharma et al. mostraram que após a redução de Q, o par iônico His-Asp é capaz de protonar Q e essa reação é a responsável pelo desbalanceamento de cargas ao longo das outras subunidades do Complexo I. A figura 4 mostra que a barreira energética da reação de protonação dos resíduos Tyr-87 e resíduo His-38 é muito menor quando Q está reduzida, evidenciando o acoplamento. A figura 5 mostra a transferência de prótons, em 5B vemos que o próton da quinona volta para o resíduo His-38, ou seja, indicando que há uma rápida dissociação dos resíduos His-Asp.

Imagem 4 e 5, respectivamente – Simulações QM/MM

Contudo, para entender a relação da desprotonação local dos resíduos Tyr-87 e Asp-139 com as mudanças conformacionais que levam ao bombeamento de prótons, Sharma et al. realizaram simulações de dinâmica molecular clássica, onde mostrou-se (imagem 6-A) que quando Q está totalmente reduzido, os resíduos Asp-139 e His-38 se mantém próximos via ligação de hidrogênio e quando há protonação de Q essa ligação de hidrogênio se dissocia, mostrando que o hidrogênio que conectava ambos os resíduos é captado por Q, em 6-B mostra-se a longa mudança conformacional sofrida pelo E-channel. Portanto, há confirmação nas simulações de que a dissociação da ligação de hidrogênio dos resíduos His-Asp é responsável pelas mudanças de conformação sofridas nas subunidades seguintes, e para obter confirmação realizou-se mutação sítio-dirigida no resíduo Asp-139 para obter verificação experimental da situação.

Imagem 6 – Simulação de dinâmica molecular clássica

Análise da dissociação do resíduo Asp-139 na mudança de conformação
Para analisar a importância do resíduo Asp-139 nas alterações conformacionais geradas, mutou-se o resíduo para uma Aspargina (Asn) e então comparou-se com o wild-type. Descobriu-se que a atividade oxidoredutiva do mutante do mutante é significativamente reduzida, para cerca de 25% do wild-type. Porém, o potencial de membrana gerado sugere que o mutante ainda é capaz de bombear prótons através da membrana, mesmo que em uma taxa menor.
Para entender-se melhor esta atividade residual do mutante, gerou-se simulações in sílico do mutante. Surpreendentemente, descobriu-se que após a primeira transferência de próton para Q²-, a molécula QH- se afasta do resíduo Tyr-87 em direção a membrana, ou seja, é possível que neste mutante o movimento de QH- substitua a alteração conformacional gerada por Asp-139 no wild-type, assim gerando a atividade residual que foi observada anteriormente.
Tudo isto sugere que as alterações conformacionais geradas por His-Asp é fundamental para a transferência de elétrons e o bombeamento de prótons do complexo 1.

Mas, como as alterações conformacionais em Nqo4 podem afetar Nqo8?

A dissociação do resíduo Asp-39 gera mudanças conformacionais na região da subunidade Nqo8, o que é notável uma vez que esta se encontra a quase 40 Angstrons de distância do sitio Q. Isso ocorre pois o desbalanceamento de cargas no sitio Q gera uma perturbação em resíduos carregados na subunidade Nqo8, assim o down-flip de Asp-139 causa uma serie de rearranjos que por fim levam aos glutamatos presentes no E-channel a flip-up e se aproximar do N-side da membrana. Tudo isso, cria um excesso de carga negativa que futuramente pode levar a protonação de resíduos presentes no E-channel. Portanto, a dissociação do resíduo Asp-139 gera mudanças conformacionais que rearranjam resíduos carregados, assim explicando como as mudanças conformacionais presentes em Nqo4 estão ligadas as mudanças em Nqo8.

Conclusão
Com todos os resultados obtidos, podemos concluir que não é a oxidação de NADH que gera diretamente o bombeamento de prótons. Nem mesmo podemos afirmar que QH2 é responsável por isto, mas sim a sua formação. A redução de quinona gera um desbalanceamento de cargas ao causar a dissociação de Asp-139 e consequentemente gera uma serie de rearranjos e mudanças conformacionais que levam a um contato entre os resíduos de glutamato presentes em Nqo8 com o N-side da membrana e a movimentação de prótons. Portanto, o grande responsável pela ativação do bombeamento de prótons é na verdade uma combinação entre as transições eletrostáticas e conformacionais.

 

Bibliografia:

http://gaznevada.iq.usp.br/wp-content/uploads/2016/08/kaila-15_ComplexI_QCMM_redox.pdf

http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=3m9s

Minha proteína de membrana – 2016

Vejam abaixo uma lista de proteínas de membrana e de artigos associados. Cada dupla de alunos deverá preparar um relatório crítico na forma de um website que será publicado aqui, explicando o(s) resultado(s) principal(is) do artigo com suas próprias palavras.

O relatório deverá começar com o título e os nomes dos autores do artigo e conter uma breve introdução (max. 1 parágrafo) descrevendo a função da sua proteína de membrana. Em seguida, a estrutura geral da proteína deve ser descrita e analisada (max. 2 parágrafos), com atenção às interações com lipídeos. As técnicas envolvidas, suas qualidades e limitações também devem ser descritas sucintamente (max. 1 parágrafo). Esta parte, limitada a 4 parágrafos no máximo, será a introdução e a descrição da metodologia do seu trabalho. O restante do relatório deverá explicar detalhadamente a pergunta respondida ou o fenômeno estudado no artigo, sem limite de parágrafos.

Assim, o relatório não deve ser uma cópia ou tradução do artigo. Tente analisar criticamente o problema proposto e os resultados obtidos. Apenas figuras e tabelas (se houverem) podem ser copiadas do artigo.

Espera-se que o relatório sirva como guia para seus colegas compreenderem os resultados apresentados em cada artigo e para catalisar uma discussão sobre os mesmos.

Notem as datas importantes dadas no calendário entregue em sala para:

  • Enviar por escrito um esquema simples (1 página) descrevendo os tópicos que pretende abordar no relatório. Indique claramente qual(is) o(s) principal(is) resultado(s) do paper;
  • Apresentar por 15 minutos o website com o relatório da sua proteína de membrana aos colegas;
  • Fazer perguntas, respostas e discussões sobre cada proteína e relatório na seção de comentários criada em cada website.

Veja a lista das proteínas de membrana e dos artigos associados:

Notem que a seção “Supporting” ou “Supplementary Information” (SI) encontrada em alguns artigos não faz parte do artigo principal, exceto pelas seções de Materiais e Métodos, que em alguns artigos são transferidas do texto principal. Estas informações suplementares (SI) são incluídas para explicar detalhes dos experimentos e resultados obtidos.